Gengewinnung und Reverse Transkriptase

Etwa eins von 2000 weißen Kindern leidet unter der Erbkrankheit Mucoviscidose (cystische Fibrose), die rezessiv vererbt wird. Das vom Gen für cystische Fibrose codierte CFTR-Protein kontrolliert in der Zellmembran den Chlorid-Ionenaustausch. Ist dieser Austausch gestört, kommt es u.a. zur Bildung von abnormen zähflüssigem Schleim. In der Lunge führt dies zu einer Verstopfung der Bronchien und zur Bildung von fibrösem Narbengewebe (daher der Name). Die Patienten leiden unter akuter Atemnot. Das Gen für die Krankheit befindet sich auf dem langen Arm des Chromosoms 7. Es umfasst 250 000 Basenpaare und besteht aus 24 Exons, die für das aus 1480 Aminosäuren bestehende CFTR-Protein codieren. Damit besteht das Gen nur aus knapp 2% für cystische Fibrose codierende DNA, den Rest bilden Introns.
Da die Lunge verhältnismäßig anfällig für Virusinfektionen ist, wurde diese Krankheit ausgewählt, um ein gesundes Gen in menschliche Zellen einzuschleusen. Den Transport sollen „verkrüppelte“ Adenoviren übernehmen. Um dies zu bewerkstelligen, benötigt man das Gen für das CFTR-Protein.

Worum gehts?

Grundsätzlich gibt es drei Methoden, um Gene zu gewinnen. Die eleganteste Methode ist wieder die Verwendung von Enzymen. Wie das funktioniert, wird hier erklärt.

Gegewinnung

… aus dem Genom

  • der DNA-Abschnitt wird direkt aus dem Spenderorganismus gewonnen
  • verwendet werden Restriktionsenzyme
  • Voraussetzung:
    • das Gen ist genau lokalisiert
    • Schnittstellen für die Restriktionsenzyme sind bekannt
  • Anwendung vor allem bei kleineren Genomen (Bakterien, Viren)
  • nach Auftrennung mittels Gelelektrophorese wird das Gen mit einer Gensonde aufgespürt

… aus Proteinvorlagen

  • Wenn die Aminosäuresequenz eines Proteins bekannt ist und man die mRNA nicht isolieren kann, lässt sich auf Grundlage der AS-Sequenz auch eine künstliche DNA-Sequenz herstellen.
  • Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann man Gene herstellen, die so in der Natur nicht vorkommen.
  • 1988 konnte man täglich DNA Fragmente mit 30 Basen herstellen, heute ist man in der Lage mit entsprechenden Automaten ganze Gene nach Maß in wenigen Stunden herzustellen.
  • Will man menschliche Gene, wie in der Einleitung dargestellt, verwenden, so hat man das Problem, dass die DNA Introns enthält.
  • Beim CTFR- Gen sind das immerhin 98% an „Nonseninformation“.
  • Würde man aus diesem Gen direkt eine RNA synthetisieren, dann enthält diese auch die übersetzten Abschnitte der Introns, das Protein wäre unbrauchbar.

… durch Transkription rückwärts

  • Ein „Zuschneiden“ mittels Restriktionsenzymen wäre zu aufwendig und zu ungenau. Besser ist es, die mature mRNA zu verwenden, denn hier hat die Zelle schon die Introns herausgeschnitten, sie hat die Arbeit gemacht.
  • Die mRNA lässt sich aber nicht in ein Plasmid einbauen (Einzelstrang gegen Doppelstrang), das man in ein Bakterium einschleusen kann.
  • Es wird also ein „Werkzeug“ benötigt, mit dem es möglich ist, aus einer mRNA eine DNA herzustellen. Diese Aufgabe übernimmt die Reverse Transkriptase der Retroviren. Mit ihr ist es möglich RNA in DNA umzuschreiben.

Reverse Transkriptase

  • Enzym, das durch einen rückläufigen Transkriptionsvorgang DNA synthetisieren kann.
  • Mittels der Reversen Transkriptase wird aus der RNA eine DNA – Strang synthetisiert.
  • DNA, die durch Kopieren einer RNA entstanden ist, nennt man copy-DNA oder complementary-DNA (cDNA).