Scheren und Kleber

Worum gehts?

Restriktionsenzyme sind das Werkzeug der Molekularbiologen, mit dem sie punktgenau DNA zerschneiden können. Wie diese Scheren arbeiten, wird hier besprochen.

Nach dem Schneiden muss wieder alles zusammengefügt werden. Hier kommen Ligasen zum Einsatz.

Retriktionsenzyme die Scheren

  • Restriktionsendonucleasen (Restriktasen)
  • Bakterien schützen sich damit gegen Bakteriophagen
  • Restriktasen zerschneiden normalerweise Viren-DNA

Das Enzym EcoRI

Vom 5´-Ende gelesen besitzen die Erkennungssequenzen die gleiche Basensequenz.
  • benannt nach dem E. coli Stamm RY 13
  • hat die Schnittstelle: „GAATTC“ und zwar zwischen G und A
  • am komplementären Strang (CTTAAG) spaltet Eco RI auch zwischen A und G
  • viele Restriktasen zerschneiden die DNA an bestimmten Basenpaaren

Erkennungssequenzen sind Palindrome

  • Bei den Erkennungssequenzen handelt es sich in der Regel um Palindrome wie „OTTO, stets, Regallager oder Reliefpfeiler“.
  • Das sind Zeichenketten, die von vorn und von hinten den gleichen Begriff ergeben.

Die klebrigen Enden – „sticky ends“

  • Die zerschnittene DNA zerfällt bei niedriger Temperatur nicht in zwei Teile, weil die überstehenden Enden lose aneinander kleben, sogenannte klebrige Enden („sticky ends“). A und T sowie C und G der „sticky ends“ ziehen sich noch elektrostatisch an.
  • Verschiedene Enzym-Scheren erzeugen gleiche Enden.
  • Mit ATP verbrauchenden Ligasen lässt sich die Verbindung wieder herstellen.

Wie Restriktionsenzyme schneiden

Hpa 1 mit dem glatten Schnitt

Einige Restriktionsenzyme erzeugen glatte Schnitte (glatte Enden, blunt ends).

Einige Enzym – Scheren erzeugen komplementäre Enden

  • Die Restriktionsenzyme BamHI (Erkennungssequenz GGATCC) und Bg/II (Erkennungssequenz AGATCT) lassen beide klebrige Enden mit der gleichen Sequenz GATC entstehen.
  • Die dadurch entstandenen Enden können sich verbinden und lassen sich dann mittels Ligasen „verkleben“.
  • Ein Schneiden ist dann nicht mehr möglich.
  • Machen Sie die Schnittstellen sichtbar und verbinden Sie die verschiedenen Stücke (drug & drop)
  • Nach dem Zusammenfügen der „klebrigen Enden“ geht das Palindrom verloren.

Die Ligase – der Kleber

  • Die entstandenen Genfragmente, die mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen geschnitten wurden und über komplementäre „klebrige Enden verfügen, können mittels Ligasen verbunden werden.
  • Ein Schneiden ist anschließend nicht mehr möglich, da durch das „Verkleben“ eine Sequenz entsteht, die kein Palindrom darstellt.

Zusammenfassung

  • Restriktasen und Ligasen ermöglichen das gezielte Schneiden und Verbinden von DNA-Molekülen.
  • Sie sind Scheren und Kleber der Molekulargenetik.
  • Heute sind über 3500 Restriktionsenzyme bekannt, nur einige sind geeignet für die Gentechnik.