{"id":2114,"date":"2020-06-06T12:51:59","date_gmt":"2020-06-06T10:51:59","guid":{"rendered":"http:\/\/bioclips.info\/?page_id=2114"},"modified":"2020-06-06T12:57:02","modified_gmt":"2020-06-06T10:57:02","slug":"insulinherstellung","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/bioclips.info\/?page_id=2114","title":{"rendered":"Insulinherstellung"},"content":{"rendered":"\n

Diabetes ist die Zivilisationskrankheit Nummer eins. Beim Typ I werden die Langerhans\u00b4schen Inseln durch das Immunsystem zerst\u00f6rt. Dieser Typ tritt vor dem 20. Lebensjahr auf. Beim Typ II (Altersdiabetes), der bei den meisten Diabetikern vorkommt, liegen zwar normale oder erh\u00f6hte Insulinspiegel im Blut vor, aber durch Ver\u00e4nderungen am Wirkort des Hormons, wird seine Funktionsf\u00e4higkeit herabgesetzt.
Der Bedarf an Insulin ist extrem hoch. Durch den Einsatz gentechnisch ver\u00e4nderter Bakterien l\u00e4sst er sich heute leichter decken als fr\u00fcher. Vor dem Einsatz von Bakterien gewann man Insulin aus den Bauchspeicheldr\u00fcsen von Schweinen oder Rindern. Ein Diabetiker verbrauchte zur Deckung seines Jahresbedarfs Bauchspeicheldr\u00fcsen von ca. 50 Schweinen.<\/p>\n\n\n\n

Worum gehts?<\/h2>\n\n\n\n

Es wird erl\u00e4utert, welche zellinternen Vorg\u00e4nge in den Beta-Zellen ablaufen, die zum aktiven Insulin f\u00fchren.
Wie l\u00e4sst sich mithilfe von Bakterien menschliches Insulin herstellen.<\/p>\n\n\n\n

Insulin – Herstellung im Menschen<\/h2>\n\n\n\n
\"\"<\/figure><\/div>\n\n\n\n

Insulin ist ein sehr kleines Hormon, das aus zwei Aminos\u00e4ureketten (A- und B- Kette) besteht. Die A-Kette besteht aus 21 Aminos\u00e4uren, die B-Kette aus 30 Aminos\u00e4uren.<\/p>\n\n\n\n

Beide Ketten werden zun\u00e4chst als Bestandteil einer 110 AS langen Kette synthetisiert. Diese Langform ist das Pr\u00e4proinsulin.<\/p>\n\n\n\n

24 Aminos\u00e4uren dieser Vorstufe signalisieren dem Endoplasmatischen Reticulum, es aufzunehmen. Bei der Aufnahme wird diese Signalsequenz abgespalten.<\/p>\n\n\n\n

Die restlichen 86 Aminos\u00e4uren bilden das Proinsulin (A-, B- und C- Kette). A- und B-Kette treten \u00fcber Disulfidbr\u00fccken (-S-S-) in Wechselwirkung.<\/p>\n\n\n\n

Danach wird die C-Kette (C-Peptid) enzymatisch abgetrennt.
Das C-Peptid sorgt f\u00fcr eine r\u00e4umlich korrekte Ausrichtung der A- und B- Kette (Ausbildung der Disulfidbr\u00fccken), nur so ist das Insulin funktionst\u00fcchtig.<\/p>\n\n\n\n

Die Modifizierung einer Proteinvorstufe w\u00e4hrend oder nach der Translation bezeichnet man als Protein-Prozessierung.<\/p>\n\n\n\n

Wie man mit E.coli menschliches Insulin erzeugt<\/h2>\n\n\n\n

Schritt 1<\/h3>\n\n\n\n

Die modifizierte Proinsulin-mRNA wird isoliert und durch die\u00a0Reverse Transkriptase\u00a0zu einem RNA-DNA-Hybrid synthetisiert.<\/p>\n\n\n\n

Schritt 2<\/h3>\n\n\n\n

Mithilfe von DNA-Polymerase wird der DNA-Einzelstrang vervollst\u00e4ndigt. Die cDNA ist fertig.<\/p>\n\n\n\n

Schritt 3<\/h3>\n\n\n\n

An die Insulin-cDNA wird enzymatisch ein Startcodon (A<\/strong>: TAC f\u00fcr AUG \u2192 Methionin, Startcodon) sowie \u201eklebrige Enden\u201c (B<\/strong>: sticky ends) angeh\u00e4ngt.<\/p>\n\n\n\n

Ergebnis<\/h3>\n\n\n\n

Die fertige \u201ePassagier-DNA\u201c besteht somit aus den \u201eklebrigen Enden\u201c, dem Startcodon sowie dem Proinsulin-Gen f\u00fcr die B-, C-, A- Ketten.<\/p>\n\n\n\n

Rekombinieren – Einbau in den Vektor<\/h3>\n\n\n\n

Die so gewonnene Fremd-DNA wird nun in den Vektor pBR322 eingebaut. Der Vektor enth\u00e4lt das Gen f\u00fcr Beta-Galactosidase und ein Gen f\u00fcr die Resistenz gegen Ampicillin.<\/p>\n\n\n\n

Schritt 1<\/h3>\n\n\n\n

Durch Schneiden mit Eco RI soll der Einbau der Fremd-DNA mitten im Gen f\u00fcr Galactosidase erfolgen.<\/p>\n\n\n\n

Schritt 2<\/h3>\n\n\n\n

Es entstehen \u201eklebrige\u201c Enden, die zur Fremd-DNA komplement\u00e4r sind.<\/p>\n\n\n\n

Schritt 3<\/h3>\n\n\n\n

Durch die Wechselwirkung der \u201eklebrigen\u201c Enden f\u00fcgt sich die Fremd-DNA in das Plasmid ein.<\/p>\n\n\n\n

Schritt 4<\/h3>\n\n\n\n

Die L\u00fccken werden durch DNA-Ligasen geschlossen. Das rekombinierte Plasmid ist fertig.<\/p>\n\n\n\n

Bedeutung des Operons f\u00fcr die Genexpression<\/h4>\n\n\n\n

Durch den Einbau des Proinsulin-Gens in das Galactosidase-Gen kann man das\u00a0Lac-Operon\u00a0f\u00fcr die Genexpression nutzen. Gleichzeitig sch\u00fctzt das Galactosidase-Protein den Insulinanteil vor zelleigenen Enzymen, den Proteasen, die vor allem kleinere Proteine sofort zerlegen.<\/p>\n\n\n\n

Moderne Verfahren verwenden zur Aufnahme des Proinsulin-Gens das Tryptophan-Synthase-Gen, das durch Enzymrepression kontrolliert wird. Das\u00a0Typtophan-Operon\u00a0enth\u00e4lt zus\u00e4tzlich einen Mechanismus, der bei Trypthophanmangel die Genexpression verst\u00e4rkt, was sich technisch gut nutzen l\u00e4sst.<\/p>\n\n\n\n

Transformieren \u2013 Selektieren – Klonieren<\/h3>\n\n\n\n
\"\"<\/figure><\/div>\n\n\n\n

Exprimieren – Modifizieren<\/h3>\n\n\n\n

Durch Zugabe von Lactose wird die Genexpression in Gang gesetzt. Das Beta-Galactosidase-Gen mit eingebautem Insulin-Gen wird exprimiert. Es entsteht ein Fusionsprotein aus Galactosidase und Proinsulin.<\/p>\n\n\n\n

Das Genprodukt wird mittels Zentrifugation aus dem N\u00e4hrmedium isoliert. Mit Bromcyan trennt man den Beta-Galactosidase-Teil vom Proinsulin, indem es die daf\u00fcr eingebaute Aminos\u00e4ure Methionin zerst\u00f6rt.<\/p>\n\n\n\n

Das Proinsulin wird mit dem Enzym Trypsin zum Insulin modifiziert. Da die Bakterien nicht \u00fcber das notwendige Enzym verf\u00fcgen, muss es nach der Reinigung zugegeben werden.<\/p>\n\n\n\n

Interferon-Herstellung durch Bakterien<\/h4>\n\n\n\n

Die Bedeutung der Expression menschlicher Gene in Wirtszellen (Bakterien, Hefen) wird auch an folgendem Beispiel Interferon deutlich. Als Wirkstoff bei der Behandlung von Krebs oder Multipler Sklerose war er vor der Herstellung mit gentechnisch ver\u00e4nderten Bakterien nur wenigen Menschen zug\u00e4nglich. Interferon wurde bis dahin aus Blutzellen gewonnen. F\u00fcr 400mg Interferon wurden 50 000 Liter Blut ben\u00f6tigt. Heute l\u00e4sst es sich durch rekombinierte E. coli \u2013 Zellen in beliebiger Menge herstellen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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