{"id":2049,"date":"2020-06-06T09:50:51","date_gmt":"2020-06-06T07:50:51","guid":{"rendered":"http:\/\/bioclips.info\/?page_id=2049"},"modified":"2021-03-20T16:46:08","modified_gmt":"2021-03-20T15:46:08","slug":"dna-sequenzierung-kettenabbruchmethode-nach-sanger","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/bioclips.info\/?page_id=2049","title":{"rendered":"DNA-Sequenzierung &#8211; Kettenabbruchmethode nach SANGER"},"content":{"rendered":"\n<p>1975 entwickelte Frederick Sanger ein enzymatisches Analyseverfahren zur Bestimmung der Basenabfolge in DNA \u2013 Molek\u00fclen. Frederick Sanger war damals in der Lage die Reihenfolge von 5 Basen in der Woche zu bestimmen. In Bezug auf die Analyse des menschlichen Genoms mit 3,5 x 10<sup>12<\/sup>&nbsp;Basenpaaren ein schier unl\u00f6sbare Aufgabe. Genome von Pflanzen und selbst niedere Organismen k\u00f6nnen noch gr\u00f6\u00dfere Genome enthalten. So hat Weizen eine Genom mit 1,6 x10<sup>13<\/sup>&nbsp;und eine Am\u00f6benart 1,2 x 10<sup>14<\/sup>&nbsp;Basenpaare. Heute kann man DNA \u2013 Str\u00e4nge von 1000 bp in verh\u00e4ltnism\u00e4\u00dfig kurzer Zeit auslesen.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"25\" height=\"25\" class=\"wp-image-962\" style=\"width: 25px;\" src=\"https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon.jpg\" alt=\"\" srcset=\"https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon.jpg 512w, https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon-150x150.jpg 150w, https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon-300x300.jpg 300w, https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon-270x270.jpg 270w, https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon-192x192.jpg 192w, https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon-180x180.jpg 180w, https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2018\/12\/cropped-favicon-32x32.jpg 32w\" sizes=\"(max-width: 25px) 100vw, 25px\" \/> Worum gehts?<\/h2>\n\n\n\n<p>Die Kettenabbruchmethode ist ein Verfahren, um die Reihenfolge der Nucleotidbasen in der DNA zu bestimmen.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Funktionsprinzip<\/h2>\n\n\n\n<ul><li>Durch den Abbruch der Replikation an genau definierten Stellen (z.B.: nach der Nucleotidbase mit Adenin) lassen sich DNA-Fragmente unterschiedlicher L\u00e4nge herstellen.<\/li><li>Der L\u00e4ngenunterschied der gewonnenen &#8222;DNA-Schnipsel&#8220; betr\u00e4gt 1 Nucleotid.<\/li><li>Diese werden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt.<\/li><\/ul>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Wie der Abbruch erzeugt wird<\/h3>\n\n\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"550\" height=\"240\" src=\"https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2020\/06\/ddntp.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-2057\" srcset=\"https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2020\/06\/ddntp.jpg 550w, https:\/\/bioclips.info\/wp-content\/uploads\/2020\/06\/ddntp-300x131.jpg 300w\" sizes=\"(max-width: 550px) 100vw, 550px\" \/><\/figure><\/div>\n\n\n\n<ul><li>Der Abbruch erfolgt durch den Einbau ver\u00e4nderter Nucleotide, die eine Anlagerung nachfolgender Nucleotide nicht zulassen.<\/li><li>Dem modifizierten ddNTP fehlt am 3\u00b4-Ende die Hydroxylgruppe (-OH), ein Nucleotid kann sich nicht mehr anlagern, es kommt zu Abbruch (Termination)<\/li><li>Im Versuchsansatz mit Adenin &#8211; ddNTP wird immer nach Adenin die Replikation abgebrochen.<\/li><li>F\u00fcr die anderen Nucleotidbasen muss ein entsprechender Versuchsansatz angefertigt werden.<\/li><li>Damit erh\u00e4lt man 4 Proben mit Abbruch nach Adenin, Abbruch nach Thymin &#8230;<\/li><\/ul>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Wie der Kettenabbruch z.B. bei Adenin funktioniert<\/h3>\n\n\n\n<p>Der Versuchsansatz f\u00fcr Adenin enth\u00e4lt:<\/p>\n\n\n\n<ul><li>die zu untersuchende DNA, die denaturiert als Einzelstrang (Matrizen-DNA) vorliegt<\/li><li>DNA-Polymerase<\/li><li>Primer (Startbereich f\u00fcr Polymerase)<ul><li>die Primer sind radioaktiv markiert, um im Anschluss die DNA-Fragmente \u00fcber einen R\u00f6ntgenfilm sichtbar zu machen<\/li><\/ul><\/li><li>modifizierte ddNTP, die daf\u00fcr sorgen, dass es zum Kettenabbruch kommt<\/li><li>das Verh\u00e4ltnis von dNTP zu ddNTP-Adenin betr\u00e4gt 200:1<\/li><\/ul>\n\n\n\n<p>&#8222;M\u00fcssten sich alle DNA-Fragmente der 4 Proben der Gr\u00f6\u00dfe nach aufstellen, dann w\u00fcrden sie sich um eine Nucleotidbase unterscheiden.&#8220;<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Verlauf<\/h2>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-embed aligncenter is-type-video is-provider-youtube wp-block-embed-youtube wp-embed-aspect-16-9 wp-has-aspect-ratio\"><div class=\"wp-block-embed__wrapper\">\n<iframe loading=\"lazy\" title=\"Kettenabbruchmethode nach Sanger\" width=\"644\" height=\"362\" src=\"https:\/\/www.youtube.com\/embed\/BaWAw24Rtf4?feature=oembed\" frameborder=\"0\" allow=\"accelerometer; autoplay; clipboard-write; encrypted-media; gyroscope; picture-in-picture; web-share\" referrerpolicy=\"strict-origin-when-cross-origin\" allowfullscreen><\/iframe>\n<\/div><\/figure>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Denaturierung und Neutralisation<\/h3>\n\n\n\n<ul><li>die Denaturierung der Doppelstrang DNA ist Voraussetzung f\u00fcr die Anlagerung der Primer<\/li><li>das Erzeugen von DNA-Einzelstr\u00e4ngen durch Temperaturerh\u00f6hung wirkt nur kurzfristig und reicht f\u00fcr eine vollst\u00e4ndige Denaturierung nicht aus<\/li><li>die Zugabe stark alkalischer Natronlauge (NaOH) bewirkt eine vollst\u00e4ndige Denaturierung<\/li><\/ul>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Primerhybridisierung<\/h3>\n\n\n\n<ul><li>ein geordneter Synthesestart erfolgt, wenn die DNA-Einzelstr\u00e4nge in linearer, einzelstr\u00e4ngiger Form vorliegen<\/li><li>die Primer lagern sich an der vorgesehenen Stelle an (Hybridisierung)<\/li><li>die Geschwindigkeit der Hybridisierung ist abh\u00e4ngig von L\u00e4nge, Gr\u00f6\u00dfe und Konzentration des Primers.<\/li><li>in der Regel ergeben sich daraus Hybridisierungszeiten von 3-5 Sekunden<\/li><\/ul>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Strangsynthese<\/h3>\n\n\n\n<ul><li>es erfolgt der Ablese- und Synthesevorgang durch die DNA-Polymerase \u00e4hnlich der Replikation<\/li><li>die dNTPs werden fortlaufend eingebaut, bis sich zuf\u00e4llig ein modifiziertes Nucleotid (ddNTP) anlagert<\/li><li>dann kommt es zum Syntheseabbruch (Kettenabbruch)<\/li><li>als Ergebnis erh\u00e4lt man einen DNA-Strang, der nur teilweise aus einem Doppelstrang besteht<\/li><\/ul>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Finale Denaturierung<\/h3>\n\n\n\n<ul><li>f\u00fcr eine exakte Gr\u00f6\u00dfenbestimmung der neu synthetisierten DNA-Fragmente unterschiedlicher L\u00e4nge m\u00fcssen diese vom Matrizenstrang getrennt werden<\/li><li>das erreicht man durch eine Denaturierung der Doppelstrangbereiche<\/li><li>Hitzebehandlung und Harnstoff, der das Ausbilden von Wasserstoffbr\u00fccken verhindert, sorgen f\u00fcr eine Denaturierung<\/li><\/ul>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\">Anmerkung<\/h4>\n\n\n\n<p>Die Sanger-Kettenabbruchmethode kann nur f\u00fcr Sequenzen von 200 bis 400 Nucleotide in einer Einzelreaktion benutzt werden. Man muss somit f\u00fcr 1000 Basenpaare verschiedene L\u00e4ufe durchf\u00fchren und dann \u00fcberlappende Sequenzen zusammenpuzzeln.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Auftrennung und Darstellung<\/h2>\n\n\n\n<p>In einer Gelelektrophorese werden die DNA-Fragmente ihrer Gr\u00f6\u00dfe nach aufgetrennt und durch die radioaktive Markierung auf einem R\u00f6ntgenfilm (Autoradiogramm) sichtbar gemacht.<\/p>\n\n\n\n<p>Die Animation simuliert die Auftrennung der Einzelstrang &#8211; Fragmente. Damit l\u00e4sst sich die Nucleotidbasensequenz bestimmen.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-embed is-type-video is-provider-youtube wp-block-embed-youtube wp-embed-aspect-16-9 wp-has-aspect-ratio\"><div class=\"wp-block-embed__wrapper\">\n<iframe loading=\"lazy\" title=\"DNA-Sequenzierung - Ergebnis\" width=\"644\" height=\"362\" src=\"https:\/\/www.youtube.com\/embed\/w_9yShBBtuk?feature=oembed\" frameborder=\"0\" allow=\"accelerometer; autoplay; clipboard-write; encrypted-media; gyroscope; picture-in-picture; web-share\" referrerpolicy=\"strict-origin-when-cross-origin\" allowfullscreen><\/iframe>\n<\/div><\/figure>\n\n\n\n<p>Das Gel f\u00fcr die Auftrennung muss so engmaschig sein, dass es den L\u00e4ngenunterschied von einer Nucleotidbase darstellen kann. Agarosegele k\u00f6nnen das nicht. Man verwendet deshalb ein Polyacrylamid-Gel.<\/p>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\">Auswertung<\/h4>\n\n\n\n<p>Das Auslesen der DNA-Sequenz beginnt mit dem k\u00fcrzesten Fragment.<\/p>\n\n\n\n<p>Dabei handelt es sich um den ersten Abbruch nach dem Primer. Es ist dem 5\u00b4-Ende des Primers am n\u00e4chsten, damit ist die Ausleserichtung festgelegt.<\/p>\n\n\n\n<p>Die Nucleotidbasenproben werden hintereinander ausgelesen (siehe Film).<\/p>\n\n\n\n<p>Dem Ausleseergebnis m\u00fcssen nun noch die komplement\u00e4ren Basen zugeordnet werden.<\/p>\n\n\n\n<p>In einer Gelelektrophorese werden die DNA-Fragmente ihrer Gr\u00f6\u00dfe nach aufgetrennt und durch die radioaktive Markierung auf einem R\u00f6ntgenfilm (Autoradiogramm) sichtbar gemacht.<\/p>\n\n\n\n<p>Die Animation simuliert die Auftrennung der Einzelstrang &#8211; Fragmente. Damit l\u00e4sst sich die Nucleotidbasensequenz bestimmen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>1975 entwickelte Frederick Sanger ein enzymatisches Analyseverfahren zur Bestimmung der Basenabfolge in DNA \u2013 Molek\u00fclen. Frederick Sanger war damals in der Lage die Reihenfolge von 5 Basen in der Woche zu bestimmen. In Bezug auf die Analyse des menschlichen Genoms mit 3,5 x 1012&nbsp;Basenpaaren ein schier unl\u00f6sbare Aufgabe. 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